一步法恒溫支原體檢測試劑盒(溶液型)說明書

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產業鏈中的國產生物試劑品質關。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業，共同創世界優秀的中國生物制造企業，圓夢中國。

產品詳情

產品描述

 哺乳動物細胞的培養，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實驗結果的不準確、甚至錯誤。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

        培養法是相對可靠的支原體檢測技術，但是該方法非常耗時的，需要數周，不適合作為細胞培養液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養法無法檢測污染細胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。

        有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，而且嚴重依賴實驗人員的經驗，實驗的穩定性極差。此外，當該方法檢測成陽性時，細胞經常已經嚴重污染。

        培養法和熒光染色法雖然是我國藥典收錄的支原體檢測方法，但是因為其各自都有明顯的缺點，不適合作為支原體快速檢測的方法。

        本公司目前已經開發出四種不同原理的快速支原體檢測試劑盒，分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》，其各自都有自己的優缺點。

        《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》使用恒溫基因擴增技術，有明顯的優點：（1）整個檢測過程只需1小時，大大縮短了檢測時間；（2）未發現細胞培養液中的PCR抑制劑會抑制恒溫基因擴增，所以一般無需進行樣品的前處理；（3）恒溫基因擴增的靈敏度良好，一般比30個循環普通PCR法高；（4）恒溫基因擴增的產物無需電泳，可以通過指示劑的顏色變化直接肉眼判斷反應結果；（5）無需用到PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀等儀器，整個檢測過程只需一個水浴鍋。

        經測試，本試劑盒至少可以檢測以下13種支原體：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M. pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis（注：M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。其中，前8種為是最常見的污染細胞的支原體種類，約占污染細胞的支原體的98%左右。以上13種約占污染細胞的支原體種類的99%左右。

        《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》的檢測靈敏度：經測試，在每個反應管的DNA加入量為2 μL的情況下，《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》的最高檢測靈敏度（即檢測下限）大約在20-400個copies，即10-200 copies/μL。可以通過離心濃縮、提取支原體基因組DNA等措施，其檢測靈敏度可以在此基礎上繼續提高10-100倍。

        由于任何一種快速支原體檢測方法都無法保證檢測結果100%正確，如果您想得到100%正確的支原體檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養的客戶，生產血清、胰酶、培養液的客戶，出售各種原代培養細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。

產品組分

（1）溶液1：1150 μL （50次檢測）；

（2）溶液2：55 μL；

（3）溶液3：指示劑，38 μL

（4）陽性支原體DNA：50 μL；     

（5）礦物油：1500 μL。

使用方法

使用方法

1. 待測樣品的準備：

     為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品需要取自換液后培養2-3天且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長2-3天再取培養液進行檢測。可以按照以下兩種方法之一進行樣品的前處理：

方法一：直接檢測（該方法無法去除可能的干擾物，顯色被干擾的可能性相對較大）：

（1）取150 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，取離心后的上清100 μL用于支原體檢測，丟棄下層剩余的50 μL（含細胞沉淀）。

（2）已經離心去除細胞的待測樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定），具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。 

方法二：簡單離心清洗（推薦方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高檢測的相對靈敏度，還可以去除絕大部分可能的干擾物，顯色被干擾的可能性極小。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除干擾物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法。）：

（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。

（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 minutes，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻【如果最初使用了1500 μL的樣品而最后用20 μL重懸，則支原體濃度大約提高了75倍，相對靈敏度也提高了75倍】。

（3）該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。

實驗案例分析

  我們選取了比較有代表性的4種支原體（分別是：M. hyorhinis，M. fermentans A. laidlawii和M. pirum），使用含相應支原體基因片段的質粒載體，經DNA定量后，計算出相應的分子數。

        質粒經4倍系列稀釋【從4^(0)到4^(-8)】，進行相應的恒溫擴增（每個反應管的DNA加入量為2μL，每個稀釋度做2個重復），并對恒溫擴增產物進行拍照。恒溫擴增反應的結果下圖所示：

注意事項

1. 請確保樣品加入后，反應之前：陰性、陽性和所有待測樣品的顏色基本一致。如果個別樣品，一旦加入，反應管的顏色就與陰性、陽性明顯不同，說明其中含有可干擾本系統正常指示效果的物質，必須先去除。此現象曾經在檢測CHO無血清培養基和一些血液制品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液等）上發生過。常見的DMEM、MEM、F12、1640等培養基（可以含10%血清）一般不會發生該現象。去除方法：（1）離心清洗：取1 mL細胞上清或待測樣品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液），先13000 rpm離心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀，吹吸均勻。該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。由于離心清洗可能導致支原體部分丟失，如果樣品支原體含量很低，可能導致漏檢。（2）使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》提取支原體DNA后進行檢測。通過DNA提取，即可以將所有可能的干擾物質全部去除，又可以將支原體DNA濃縮10-100倍。

2. 由于恒溫擴增所用的各種酶強烈依賴溶液中的二價離子，待測樣品的EDTA等金屬離子螯合劑只能微量存在。如果打算用試劑盒提取支原體DNA（推薦使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》），請用去離子水或者不含EDTA的5 mM Tris.HCl（pH 8.0-8.8）的緩沖液洗脫和溶解DNA。

3. 防DNA污染注意事項：

（1）恒溫反應體系配制的房間（本試劑盒請在有窗戶、通風良好的普通房間操作。請勿在密閉的細胞培養間進行該步驟的操作，因為細胞培養間支原體污染概率很高），與用于樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間一定要分開。

（2）強烈建議使用濾芯吸頭吸取相關溶液和陽性支原體等。如果沒有濾芯吸頭，至少應該使用新開封的吸頭。

（3）必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體。因此，最好使用全新購買的移液槍。如果沒有新購買的移液槍，至少應該使用以前沒有進行過細胞培養的移液槍。因為進行過細胞培養的移液槍極有可能被含支原體的培養液污染（如細胞培養時，不小心將含支原體污染的培養液吸入移液槍的槍體內）。移液槍中吸附的支原體有可能造成不必要的假陽性。

（4）樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對照DNA、待測樣品DNA的吸頭，務必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋，以防止陽性DNA的揮發，造成環境的污染，進而造成假陽性。

（5）整個操作過程，最好不要說話，因為人的口腔和唾液都是帶支原體的。

（6）反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的污染。結果判斷完后，將其用自封袋密閉，扔到另外一個房間的垃圾桶內。

4. 本試劑盒的檢測準確率：（1）由于本試劑盒能識別的支原體大概只占了污染細胞的支原體的99%左右，還有1%左右的污染細胞的支原體有可能不認識，這可能會導致1%左右的假陰性（漏檢）。（2）由于人體的口腔、皮膚和尿道都是含有支原體的，而且常用的腫瘤細胞系支原體污染率非常高，一般在15-90%之間，導致實驗室環境甚至移液槍也經常含有支原體，這可能導致出現極個別的假陽性（多檢，正常這種概率應該低于1%）。總體來說，單獨使用本試劑盒有可能出現1-2%左右的錯誤率（注意：細胞培養中支原體出現的概率是來自文獻數據，是大量體外細胞培養支原體污染調查的結果。如果你們實驗室細胞污染的恰巧是出現概率比較低而本試劑盒又不認識的支原體，漏檢的概率會大幅度上升。因此：對所有重要的樣品（比如，可能用于人體的細胞），不能只依靠本試劑盒就下最終檢測結論，必須至少同時使用另外一種支原體識別率為100%的支原體檢測試劑盒【比如本公司《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》】進行檢測，互相驗證！）。為了提高檢測的準確率，建議客戶采取以下兩種措施：第一，對所有本試劑盒檢測出的陽性樣品，利用本試劑盒或者其他不同原理的支原體檢測試劑盒進行復檢（復檢可以基本排除因環境污染導致的假陽性），或者檢測時所有樣品直接使用兩個反應管同時檢測檢測，只有同一個樣品兩個反應管的檢測結果都為陽性時，才能判斷為真正的陽性樣品。第二，對所有重要的樣品（比如，可能用于人體的細胞），必須至少同時使用兩種（甚至三種）不同原理的支原體檢測試劑盒（其中一種方法推薦使用支原體識別率為100%的《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》）進行檢測，互相驗證。

5. 如發現細胞被支原體污染，本公司提供細胞專用支原體清除和預防試劑，以及水浴專用殺菌劑和環境專用殺菌劑。

6. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7天，但是可靠性高。

7. 如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取以下幾種措施：（1）通過使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》，將支原體DNA濃縮提取后再進行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除），大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）對支原體進行離心濃縮：取1 mL細胞上清，先13000 rpm（約16000 g）離心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心后（1000 g，5 seconds），取上清進行檢測。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20倍。

運輸及保存方法

        該產品隨冰袋運輸，收到產品后請立即放-20 ℃冰箱保存，該條件下，至少3年內仍然有活性。

產品用途

   《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》（One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit）主要用于檢測細胞培養液或別的液體樣品中是否含有支原體。本產品僅供科研使用。